参考0 参考1 miRNA预测工具miRDeep-P2简明教程植物miRNA靶基因预测下机数据整理汇总 find -name ./msj *.clean.fastq.gz |xargs -i cp {} ./msj/clean/ 查找所有的质控过的数据，移动到clean文件夹。我的是水稻的miRNA数据。所以先下载水稻的各种文件。下载地址包括基因组序列、基因组注释、基因组蛋白质注释、基因组cds序列。下载miRNA数据下载miRNA注释文件

1. 测序下机数据质控、去接头、检测分布

1.1 质控fastqc fastqc -i ./clean/*.fastq.gz -t 4 #4个进程同时运行 1.2 去接头 miRNA的一般用cutadapt,同时去掉reads中的adapter，低质量的reads以及过长过短的reads。 cutadapt下载安装配置环境变量，参考官网环境变量在~/.bashsrc_profile 去掉接头。

cutadapt -a AGATCGGAAGAG --quality-base 33 -m 10 -q 20 --discard-untrimmed -o $Co1.fa >cutadapt.info

具体的接头文件，在fastqc的输出文件中，找adapter可以看到。 1.3 检测片段分布新建length-distribute.py python 代码如下：

#!/usr/bin/env/ python3
#Author:Frank
import sys
miRNA_len={}
#此处的60长度根据你的每行数据的最长长度设置，过小可能会报错。
for i in range(0,60):
    miRNA_len[i]=0
for i in open(sys.argv[1]):
    if i.startswith('@') or i.startswith('+'):
        continue
    length=len(i)-1
    miRNA_len[length] += 1
for i in miRNA_len:
    print(str(i)+"\t"+str(miRNA_len[i]/2))

使用方法：示例：python3 length-distribute.py ./merge/S168-Na-1_L1.fastq >S168-1.stat 实际使用脚本循环所有数据：

2. 拼接

miRNA拼接最好使用bowtie，而不是bowtie2.详情地址 2.1 bowtie的使用 -建立索引

bowtie-build  -f genome.fasta genome.fa &
bowtie-build  -f miRNA.fa miRNA.fa &
bowtie -q -v 2 -l 10 -k 15 genome.fa C01.fa -S c01.sam 2>mapping.info

此处比对我实际使用的脚本循环，因为样本量太多了。

name_array=(Co1 S168-Na STTM168 Co1-Na) 
for ((n=0;n<4;n++));
do 
    for ((i=1;i<4;i++));
    do
         read="./merge/"${name_array[$n]}"-"$i"_L1.fastq"
         bowtie -q -v 2 -l 10 -k 15 genome.fa $read -S ${name_array[$n]}"-"$i".sam" 2>>mapping.info
    done
done

在输出文件mapping.info中可以找到mapping到的比率。整体在90%以上，数据比较好。

对于miRNA比对一般有2种方式，一种是比对到基因组上，另一种是比对到对应物种的miRNA数据库中。此处的genome.fa是基因组文件。

-mi.fa 是把miRNA.fa的U碱基转换成T碱基。 -miRNA.fa 是原始的从mirbase下载的茎环结构的数据，自己命名。 bowtie分别构建上述三个基因组的索引文件。参考曾建明多年前的提问，miRNA比对到mirBase的miRNA数据库时，是需要把U转换为T的。 但是事实上，转变碱基之后的比对效果仍然很低（0.1-0.2%）。不知道原因。所以我暂时使用的是和基因组的比对结果。

3. 安装使用HTSeq（非root用户）（据说可以使用featurecount替代HTSeq）

作为非root用户，安装许多软件非常头疼。总是没有权限。先在GitHub下载htseq。下载地址

unzip  htseq-master
python setup.py build install --user

安装完成，添加环境变量。

vim ~/.bash_profile
export PATH=$HOME/chaim/.local/bin:$PATH

重启终端，测试htseq。 htseq-count -h 会出现相应的帮助信息。 HTSeq-count使用API

htseq统计counts的脚本

#!/bin/bash
name_array=(Co1 S168-Na STTM168 Co1-Na)
for ((n=0;n<4;n++));
do
        for ((num=1;num<4;num++));
        do
                htseq-count -s no -t miRNA -i ID -o ${name_array[$n]}"-"$num".hc.sam" ${name_array[$n]}"-"$num".sam" miRNA.gff3 | tee ${name_array[$n]}"-"$num".count"
                ls ${name_array[$n]}"-"$num".count" >> count.list
                #echo ${name_array[$n]}"-"$num"count"
        done
done

吐槽一下,水稻基因组本身是有2种命名格式的，基因注释是有Chr1和Chr01的格式的。所以一定要看清楚自己的注释文件和Sam文件的格式是否一致，否则会出现counts=0.

4. 表达量差异分析（R语言中操作）

无生物学重复使用DEGseq，有生物学重复使用DESeq2 无生物学重复DEGseq（以下代码摘自引用1，未经过实践。）

library("DEGseq")
#BT_0_1
geneExpMatrix1<- readGeneExp("ht.genotype_data1.txt", geneCol=1, valCol=3)
geneExpMatrix2<- readGeneExp("ht.genotype_data2.txt", geneCol=1, valCol=2)
write.table(geneExpMatrix1[30:31,],row.names=FALSE)
write.table(geneExpMatrix2[30:31,],row.names=FALSE)
pdf(file="data1_2.pdf")
layout(matrix(c(1,2,3,4,5,6),3, 2, byrow=TRUE))
par(mar=c(2,2, 2, 2))
DEGexp(geneExpMatrix1=geneExpMatrix1,geneCol1=1, expCol1=2, groupLabel1="data1",geneExpMatrix2=geneExpMatrix2,geneCol2=1, expCol2=2,groupLabel2="data2",method="MARS",outputDir="05DEmiRNA/DEGSeq")
dev.off()

有生物学重复DESeq2 (RNA-seq也可以使用它计算表达量) 使用DESeq2之前先生成矩阵,使用prepDE.py python2.7 /disks/backup/chaim/soft/prepDE.py -i gtf2 gtf2文件内容

library("DESeq")data=read.table("ht.genotype_data.txt",header=TRUE,row.names=1)pd=data.frame(row.names=colnames(data),condition=c("data3","data3","data4","data4"),libType=c("single-end","single-end","single-end","single-end"))ps=pd$libType=="single-end"ct=data[,ps]condition=pd$condition[ps]cds=newCountDataSet(ct,condition)cds= estimateSizeFactors(cds)sizeFactors(cds)cds= estimateDispersions(cds)res=nbinomTest(cds,"data3","data4")write.table(res,file="data3_data4.xls")quit()

5. miRNA样本配对mRNA表达量获取

参考差异表达分析生信菜鸟团 weibo