三代测序技术总结
第三代基因测序技术又被为“Single Molecule Real Time (SMRT™) DNA Sequencing”(单分子实时DNA测序技术) 目前的三代测序分为:10XGenomics (Illumination公司的技术),PacBio-SMRT 和Nanopore sequencing 技术缺陷: - (基于二代的改进,严格说还是二代)10XGenomics 受GC含量影响比较大。高GC时候,覆盖率会有偏向性。 - PacBio-SMRT 错误率比较高,能达到14%,可以通过多次测序来纠错。不过测序错误,没有偏向性,是随机产生的。 - Nanopore 可以直接测序DNA和RNA,读长比较长,便携,错误率和PacBio差不多。 目前比较火的单细胞转录组测序分为:Smart-seq 2和10XGenomics
三代测序的应用:
- DNA质量要求
- 必须为双链DNA(dsDNA)
- 避免反复冻溶,未经高温处理(>65°C)
- DNA保存溶液pH在6-9之间,建议保存于弱酸性换环境;
- OD260/280 在 1.8~2.0、OD260/230在2.0~2.2之间
- 澄清无色,无不溶物;
- 无RNA的污染;
- DNA未接触过紫外、荧光燃料等可能损伤DNA 的环境和物质
- 不含螯合剂(如EDTA)、二价金属阳离子(如Mg2+)、变性剂(如胍盐,苯酚)、去污剂(如SDS、Triton-X100、CTAB)
- DNA电泳条带单一,条带长度≥23kb,无明显降解
- Qubit 浓度: Nanodrop 浓度≥0.5(最好接近 1)
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RNA质量要求
- 浓度>300ng/ul
- 完整性:RIN值≥8.0;28S/18S>1;基线无上抬或轻微上抬;5S峰正常;
- 纯度:1.7 <OD260/280<2.2;OD260/230>0.5;260吸收峰正常不偏移;
- 样品状态:送样粘稠、颜色异常、有浑浊或不溶物均不合格;
- 电泳:无基因组污染;
- 样品运送前保存在-80℃冰箱;
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测序应用
- (1)全基因组denovo测序
- (2)基因组草图的优化或基因组完成图绘制
- (3)全长转录本测序
- (4)宏基因组测序
- (5)16SrDNA全长测序
- (6)细胞器基因组测序
- (7)全基因组重测序&稀有变异鉴定
- (8)表观遗传学 参考:https://blog.csdn.net/yangl7/article/details/108517129