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三代测序技术总结

第三代基因测序技术又被为“Single Molecule Real Time (SMRT™) DNA Sequencing”（单分子实时DNA测序技术） 目前的三代测序分为：10XGenomics (Illumination公司的技术)，PacBio-SMRT 和Nanopore sequencing 技术缺陷： - （基于二代的改进，严格说还是二代）10XGenomics 受GC含量影响比较大。高GC时候，覆盖率会有偏向性。 - PacBio-SMRT 错误率比较高，能达到14%，可以通过多次测序来纠错。不过测序错误，没有偏向性，是随机产生的。 - Nanopore 可以直接测序DNA和RNA,读长比较长，便携，错误率和PacBio差不多。 目前比较火的单细胞转录组测序分为：Smart-seq 2和10XGenomics

三代测序的应用：
  • DNA质量要求
    • 必须为双链DNA（dsDNA）
    • 避免反复冻溶，未经高温处理（>65°C）
    • DNA保存溶液pH在6-9之间，建议保存于弱酸性换环境；
    • OD260/280 在 1.8~2.0、OD260/230在2.0~2.2之间
    • 澄清无色，无不溶物；
    • 无RNA的污染；
    • DNA未接触过紫外、荧光燃料等可能损伤DNA 的环境和物质
    • 不含螯合剂（如EDTA）、二价金属阳离子（如Mg2+）、变性剂（如胍盐，苯酚）、去污剂（如SDS、Triton-X100、CTAB）
    • DNA电泳条带单一，条带长度≥23kb，无明显降解
    • Qubit 浓度: Nanodrop 浓度≥0.5（最好接近 1）

  • RNA质量要求

    • 浓度>300ng/ul
    • 完整性：RIN值≥8.0；28S/18S>1；基线无上抬或轻微上抬；5S峰正常；
    • 纯度：1.7 <OD260/280<2.2；OD260/230>0.5；260吸收峰正常不偏移;
    • 样品状态：送样粘稠、颜色异常、有浑浊或不溶物均不合格；
    • 电泳：无基因组污染；
    • 样品运送前保存在-80℃冰箱；

  • 测序应用

    • （1）全基因组denovo测序
    • （2）基因组草图的优化或基因组完成图绘制
    • （3）全长转录本测序
    • （4）宏基因组测序
    • （5）16SrDNA全长测序
    • （6）细胞器基因组测序
    • （7）全基因组重测序&稀有变异鉴定
    • （8）表观遗传学 参考：https://blog.csdn.net/yangl7/article/details/108517129
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